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检测DNA与蛋白质的互作,你需要关注这些新技术
发布时间:2019-06-28   点击次数:306次

不论对何种生物而言,DNA与蛋白质之间的相互作用(DPI)都是至关重要的。你想,基因的表达、复制、重组和修复,以及RNA转运和翻译,哪个离得开这种相互作用?

早在十九世纪后期,科学家们就通过显微镜观察到了蛋白质与DNA之间的相互作用。自那以后,他们开始深入探索蛋白质结合并控制DNA和RNA的机制。

总的来说,与DNA结合的蛋白是普遍存在的,大约占了高等动植物蛋白质组的10%,也就是说,各个物种平均而言约有2000个。


相互作用可能是特异性的,由核酸序列所控制,并由氢键、离子相互作用和范德华力介导。转录的控制就是一个例子。不过,也可能是非特异性的,通过蛋白功能基团与DNA骨架之间的吸引而发生。

分析方法

对于大部分的相互作用,人们只是略知皮毛。研究通常从鉴定蛋白质组分开始。常用的分析方法包括显微镜和经典的生化分析,如染色质免疫沉淀(ChIP)、指数富集的配体系统进化(SELEX)、电泳迁移率分析(EMSA)、DNase足迹分析以及蛋白结合芯片。

ChIP是让蛋白质与其DNA目标共价结合,之后将它们解交联,并分别鉴定。SELEX将目标蛋白暴露在寡核苷酸的随机文库中。之后分离出与之结合的基因并通过PCR扩增。DNase I 足迹分析定位蛋白质与DNA的结合位点,然后进行有限的DNA消化。芯片则鉴定与标记的蛋白质相关联的基因序列,随后进行荧光检测。

研究人员也采用各种显微技术来探索DNA-蛋白互作,包括光学、荧光、电子和原子力显微镜,后两者提供了zui高的空间分辨率,不过,电镜于静态观察,而不能分辨动态相互作用。

原子力显微镜(AFM)可以说是多功能的显微方法。它利用微悬臂感受和放大悬臂上微小针尖与受测样品原子之间的作用力,从而达到检测目的,具有原子级的分辨率,可探测单分子的分子间作用力。

瑞士洛桑联邦理工学院的科学家Sandor Kasas指出,高速AFM能够以极高的分辨率来探索蛋白质及相关基因的结构。“通过高速AFM,所有相互作用的动力学都可以被实时追踪,同时测定蛋白质与DNA之间的相互作用力。”

原子力显微镜的zui新应用是将蛋白质附着在针尖,然后测定它与自由漂浮的DNA之间的互作。蛋白质样品可以是溶液形式,也可以不是,这具体取决于研究人员要寻找的目标。不过,它必须固定在底物上,才能通过显微镜观察。

在快速实验中,样品可以在空气中成像。这种情况下的附着相对比较容易。不过,若要寻找互作动力学,成像必须在液体中进行,这时附着就比较复杂。“DNA必须牢固附着在表面,才能被显微镜所看见,但又不能太牢固,以便与蛋白质相互作用。有时这挺难实现的,”Kasas补充说。

当然,原子力显微镜的价格不菲。一台低速显微镜的价格大约在10万-20万美元,这意味着许多部门需要合力才能购买一台。有些机构愿意与生物学家合作。高速显微镜则是另一码事。“它们目前还很,只有几个研究组拥有,法国只有5台,而美国大概有十几台,”Kasas说。不过对于互作研究的前沿科学家而言,它们是至关重要的。
 

不断改进

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物理鉴定

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