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乔羽生物:His 融合蛋白纯化常见问题解答
发布时间:2018-12-17   点击次数:92次

蛋白过镍柱纯化的原理:Ni-NTA 纯化介质纯化带有 His6-Tag 的融合蛋白是目前蛋白纯化中常使用的一种方法。Ni 柱中的氯化镍或者硫酸镍可以与有 HIs(组蛋白) 标签的碱性蛋白蛋白结合,组蛋白标签一般是 6 个组氨酸 (碱性氨基酸)。在蛋白上样后,带有组氨酸标签的蛋白特异性结合到柱子里,其他的杂蛋白流出。Ni 柱中的氯化镍或者硫酸镍也可以与咪唑结合,采用咪唑洗脱,咪唑竞争性结合到硫酸镍上,目的蛋白就被洗脱了,这时候收集穿出液,里面就是目的蛋白,然后透析掉咪唑即可。 上样,清洗,洗脱,基本三个步骤就结束了。

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Ni-NTA 常见问题及建议

1. His 标签蛋白没有与柱结合:

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a. 可能原因:超声的功率不对 ( 太大,蛋白炭化,太小,蛋白没有释放)。 解决方法:改变超声功率,并在超声前加入溶菌酶。

b。 可能原因:样品或者是结合缓冲液不正确。 解决方法:检测 pH 及样品和结合缓冲液的组成份。确保在溶液中鳌合剂或强还原剂的浓度及咪唑的浓度不是太高。

c。 可能原因:组氨酸标签暴露不完全。 解决方法:在变性条件下 ( 用 4-8 M 脲,或 4-6 M 盐酸胍) 进行纯化。

d. 可能原因:His 标签丢失。 解决方法 1:WB 检查 His 是否表达,上游构建,改变 His-tag 的位置 (C- 端或 N- 端),必要时增加 His 个数。 解决方法 2:孵育的时间不够,降低流速和增加孵育的时间。

解决方法 3:改变螯合的金属离子,寻找到zui佳的结合金属离子。 Ni2+ 通常是从宿主细胞蛋白中纯化大多数 6×His 标记的重组蛋白质的shou选金属离子。也是一般常用的离子。蛋白和金属离子之间的结合强度受几种因素影响,包括长度、位置、亲和标记在蛋白的暴露程度、所用离子的类型、以及缓冲液的 pH,因此一些蛋白用其他离子可能更容易地进行纯化而不用 Ni2+。 2。 His 标签蛋白没有被洗脱下来:

a。 可能原因:洗脱条件太温和 (组氨酸标记的蛋白质仍然结合在柱上,结合力较强)。 解决方法:增加咪唑的梯度洗脱或降低 pH 来找出zui佳的洗脱条件。

b. 可能原因:降低 pH 的方法洗脱的,若 pH 低于 3.5,会导致镍离子脱落。 解决方法:改变洗脱办法,咪唑竞争性洗脱。

c。 可能原因:蛋白已沉淀在柱上。 解决方法: 减少上样量,或使用咪唑的线性梯度而不是分步洗脱以降低蛋白的浓度。试用去污剂或改变 NaCl 的浓度,或在变性条件 ( 去折叠) 下洗脱 ( 用 4~8 M 脲,或 4~6 M 盐酸胍)。

d. 可能原因:非特异性疏水或其他相互反应。 解决方法:加非离子去污剂到洗脱缓冲液 (如:2% Triton X-100) 或增加 NaCl 的浓度。 3. His 标签蛋白洗脱后杂带较多
 

 

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