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如何进行细胞系鉴定 你看懂了么?
发布时间:2018-12-04   点击次数:125次

很多生物医药的研究都采用培养细胞来进行, 这些细胞可能是从细胞库 (如美国 ATCC,American Type Culture Collection) 得来,也可能是受赠于其它研究人员,尤其在中国,目前细胞的传播太复杂,无序,很多都不是通过正规途径获得,如友情赠送等。
 

据统计,约有 30% 细胞系被交叉污染或错误辨识,因使用了交叉污染或错误辨识的细胞会导致研究结论错误、结果不可重复、临床细胞治疗失败等。不仅浪费大量时间、精力和金钱,还可能造成不可挽回的灾难性后果。为此,很多细胞库现在都要对提交来的细胞系进行鉴定,并对细胞系之间的交叉污染进行监测。

 


 

细胞系鉴定的必要性

1、各种杂志多次发出呼吁,要求研究者对细胞进行鉴定,NIH 等机构也将细胞系鉴定作为基金申请的前提条件。

2011 年,美国专门颁布了细胞 STR 鉴定国家标准;

2014 年 12 月、2015 年 2 月 Science 杂志分别发表文章专题阐述细胞交叉污染和错误辨识的严重性;

2015 年 4 月 Nature 通知:Nature 旗下所有杂志将要求作者鉴定论文中所用细胞系;

2015 年 6 月即有报道称一科学家因用错细胞系,撤销 Nature 论文。
 

目前要求提供细胞鉴定数据的期刊有:Nature、BioTechniques、Cancer Research、Cancer Discovery、Clinical Cancer Research、Molecular Cancer Research、Cancer Prevention Research、International Journal of Cancer、Molecular Cancer Therapeutics、Cell Biochemistry and Biophysics、Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention、In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal 等。
 

2、ATCC 和 FDA 要求对用于制药领域的实验中所使用的材料 — 诸如细胞系 — 应该进行「身份鉴定」和纯度测试。

此外,FDA 建议研究人员在培养细胞的较早阶段(细胞培养周)来鉴定细胞系的身份。细胞在被冻存前应再一次进行鉴定; 对于活跃生长的细胞, 每两个月应鉴定一次;文献发表前也应对细胞系身份进行鉴定。如果一个实验室使用不止一种细胞系, 则应在实验开始时, 就要对所有的细胞系进行鉴定, 以便排除交叉污染。
 

3、2015 新版药典中,规定新建细胞系/株、细胞库(MCB、WCB)和生产终末细胞均应进行鉴别试验,以确认为本细胞,且无其他细胞的交叉污染。

细胞鉴别试验方法有多重,包括细胞形态、生物化学法(如同工酶试验)、免疫学检测(如同工酶试验)、免疫学检测(如组织相容性抗原、种特异性免疫血清)、细胞遗传学检测(如染色体核型、标记染色体检测)、遗传标志检测(如 DNA 指纹图谱,包括短串联重复序列(STR)、限制片段长度多态性(RFLP-PCR)和内含子多态性(EPIC-PCR)法等)以及其他方法(如杂交法、PCR 法、报告基因法等)。应至少选择上述一种或几种方法对细胞进行种属和细胞株间及专属特性的鉴别。(——《生物制品生产检定用动物细胞基质制备及鉴定规程》)

 

何时需要进行细胞系鉴定?

● 发表相关文章或申请课题经费
● 应用细胞系作为生物药研究的实验材料
● 使用细胞进行临床治疗(试验)
● 准备冻存保种或已冻存多年的细胞
● 一个涉及到细胞试验项目开始/结束
● 新得到的细胞或实验室传 5 代以上的细胞
● 细胞系表现不稳定或结果与预期差别较大

 

细胞系鉴定方法
 

细胞培养中可以使用许多方法对交叉污染进行鉴定,如同功酶分析、染色体组分型、人淋巴细胞抗原 (HLA) 分型和扩增片段长度多态性 (AFLP) 的特征分析、STR 分析等。
 

近年来,大量研究表明 STR 基因分型方法是进行细胞交叉污染和性质鉴定的有效和准确的方法之一,STR 基因分型已经被 ATCC 等细胞库组织作为金标准应用于细胞系鉴定 (ANSI/ATCC ASN-0002-2011)。美国的 ATCC 细胞库、德国的 DSMZ 细胞库以及日本的 JCRB 细胞库等为 STR 分型提供了各细胞株的数据供比对。
 

STR 基因位点由长度为 3~7 个碱基对的短串联重复序列组成,这些重复序列广泛存在于人类基因组中,可作为高度多态性标记,被称为细胞的 DNA 指纹,其可通过一定的计算方法,即可根据所得的 STR 分型结果与专业的细胞 STR 数据库比对从而推算出样品所属的细胞系或可能的交叉污染的细胞系名称。

 

STR 鉴定的试验流程
 

细胞 DNA 提取——多色荧光体系复合扩增——DNA  pian段分离荧光信号检测——数据分析得到的基因分析和图谱——与数据库对比和结果分析——出具数据报告

 

看到这里,您是否 get 到了细胞系鉴定的新技能,迫不及待想看看自己冰箱里的细胞系还是不是当初的那个她呢?

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