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实验记录:原代脑微血管内皮细胞(BMEC)分离步骤
发布时间:2018-10-17   点击次数:290次

看到好多宝宝关于原代提取中都有疑问,这个是我们实验员在做原代脑微血管内皮细胞(BMEC)时,我们这边做的一个实验记录及分离步骤,仅仅供大家参考。

一、实验材料:

SD 大鼠(4~6 周龄,雄性),大号手术剪,镊子,50 ml 离心管,6 孔板,75% 乙醇,生理盐水,胶原酶,25% BSA,多聚赖氨酸,DMEM/F12 基础培养基,DMEM/F12 完全培养基

二、实验仪器:

超净工作台,低速离心机,二氧化碳培养箱

三、实验步骤:

1. 将大鼠对大鼠实行 anlesi,浸泡在 75% 乙醇中约 1 min
2. 剪开头部皮肤,快速取出大脑,尽量保证完整性
3. 将大脑放入预冷的 DMEM/F12 基础培养基中
4. 在超净工作台中,去掉外层血痂,脑膜,外层血管(平皿上操作)
5. 去掉白质(松散状),保留灰质(贝壳状的左右脑)。
6. 4 ℃ 预冷培养基多次清洗
7. 将大脑剪成 1 mm3 的块状,转移至无菌的 50 ml 离心管中,将块状大脑剪碎,移液枪吹打。
8. 900 rpm 室温离心 4 min,弃去上清,然后添加 5 ml DMEM/F12 无血清培养基用移液枪吹打均匀,然后补加 10 ml 培养基,加 100 μL 胶原酶Ⅱ,37 ℃ 消化 30~45 min,同时用 1 ml 多聚赖氨酸包被 6 孔板。

消化完成后加入培养基中和,900 rpm 室温离心 10 min。

直接加入 15 ml 25% BAS,2 000 rpm 室温离心 20 min。离心后离心管出现分层,下层深红色(少量)为脑微血管细胞。

生理盐水轻轻冲洗 6 孔板中多余的多聚赖氨酸,冲洗 2 次。

取下层脑微血管沉淀,加入生理盐水混匀,900 rpm 室温离心 5 min。用新鲜 DMEM/F12 完全培养基将细胞重悬,重悬后转移至 6 孔板中培养。

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