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3重组质粒是怎么筛选和鉴定的呢?
发布时间:2018-08-27   点击次数:718次

重组质粒的筛选是质粒构建的重要步骤,重组子是筛出来的,这个命题没有问题。问题是关键步骤不在筛选。影响重组质粒构建效率的关键步骤在于酶切,不管是否是定向克隆还是非定向克隆。酶切的关键在于切干净,彻底的酶切反应是成功的一半,尤其是载体的酶切。

 

 


1)  酶切反应的前提是对质粒载体的大致定量,一般大小的质粒(3-5kb)一次连接的用量在100ng左右,一般挖胶回收的损失在50%左右,为保证一次酶切反应可以进行至少三次连接,质粒载体的量在1微克左右较合适。太多的载体用量对酶切效率有负面影响,而太少的质粒载体不能保证实验的需要。


2)  然后使用过量2倍以上的酶量进行反应(按照酶切时间一小时计算,酶活性单位的定义可以参见公司的目录,一般一个单位的定义是指推荐条件下消化1微克的lambda DNA所需的酶量),反应时间2小时——过夜(不要超过10小时)。我们实验室一般采用较长的酶切时间,没有遇到过问题,但是也有实验室酶切时间控制较严格。但是原则是质粒载体一定要酶切彻底。


3)  挖胶回收,现在很多的国产试剂盒可以保证50%以上的回收效率。采用低熔点胶或电洗脱也是很多实验室的选择。


4)  连接,关键点是载体和片断的比例以及用量。对于定向克隆片断与载体的摩尔比一半大于2,非定向克隆一般大于5-10。一般大小的质粒载体(3-5kb)一次连接的用量在100ng左右。胶回收后建议对载体和片断进行定量。连接反应我们一般使用NEB的连接酶或Takara的ligation 试剂盒,这两种产品允许快速连接。其它很多公司的普通连接酶也不错。


5)  在影响克隆效率的诸多因素中酶切效率是为关键的步骤,因为酶切不彻底导致的空载体背景是绝大多数克隆操作失败的原因,极少数酶切反应不彻底的产物可能在转化后形成非常高的空载体背景。对于非定向克隆来说,碱性磷酸酶消化是另一非常关键的步骤,但是这也是在建立在酶切反应彻底的前提之下。
重组子筛选时,对于定向克隆我们一般挑取的菌斑数为4个,对于非定向克隆,我们一般挑取8个,如果筛不到重组子,我们一般从酶切载体开始重做,因为我们发现,4-8个菌落中挑不到重组子时,继续筛选所费的努力通常得不偿失。

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