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凝胶迁移实验(EMSA)实验方法
发布时间:2019-11-18   点击次数:57次

凝胶迁移实验有称凝胶阻滞实验或电泳迁移率实验(EMSA,electrophoretic mobility shift assay),是一种用于蛋白与核算相互作用的技术。初是用于转录因子与启动子相互作用的验证性实验,也可应用与蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究。

一、实验原理

EMSA主要基于蛋白-探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。根据实验设计特异性和非特异性探针,当核酸探针与样本蛋白混合孵育时,样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物;这种复合物由于分子量大,在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢,而没有结合蛋白的探针则较快;孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后,蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带,说明有蛋白与目标探针发送互作。

二、实验操作步骤

1、SHIYANQIANZHUNBEI

(1)HELIDESHIYANFANGAN

GENJUYANJIUMUDEHELISHEJITEYIXINGTANZHENSHIYANZUYIJIFEITEYIXINGTANZHENDUIZHAOZU,RUYOUBIYAOHAIKEYITIANJIATEYIXINGKANGTIZU、TEYIXINGHESUANJINGZHENGZUDENG

(2)YANGBENZHIBEI

KEYIXUANZETIQUYANGBENDEZONGDANBAI、HEDANBAIHUOZHESHIYONGCHUNHUAHAODEMUDEDANBAI。DUIYANGBENDANBAIJINXINGDINGLIANG,SHIYANZHONGDENGLIANGJIARUDANBAI。

(3)TANZHENZHIBEI

根据实验要求设计不同的探针并添加标记,可以合成核酸后自行添加,部分已知蛋白有商业化的抗体也可以直接购买。现在大多数实验室已经不再使用放射性标记,生物素使用相对较多。

2、形成蛋白-探针复合物

(1)ZAI0.5mlLIXINGUANZHONGANSHUNXUJIANGXIALIEZUFENHUNYUN:

蛋白样本(2-5μg)Xμl
poly d(I-C)1μl
Binding Buffer2μl
Nuclease-Free ddH2OXμl
总体积9μl

(2)BINGYU5minHOU,JIARU1μTANZHEN。(DUIZHAOZUJIA1ulDUIZHAOTANZHEN)

(3)PCR仪中室温(20-23℃)温育30min。

3、制备凝胶,电泳

(1)ZHIBEI6.5%FEIBIANXINGJUBINGXIXIANANNINGJIAO:(ZHUYIGENJUSHIJIQINGKUANGANBILIDIAOZHENGZONGTIJI)

5XTBE1ml
30%Acrylamide/Bis2.2ml
deionized,sterilewater6.62ml
80%Glycerol80μl
10%AP90μl
TEMED10μl
总体积10ml

彩搜网(2)ANBIAOZHUNBUZHOUZHIBEININGJIAO。

彩搜网(3)JIAYANGQIANXIANZAIYULENGDE0.5X TBE bufferZHONG120VYUDIANYONG10min,YUDIANYONGWANBIHOUCHONGXIJIAYANGKONG。

(4)HUNHEYANGBENJIDIANYONGHUANCHONGYE,DIANYANGDIANYONG。


(5)将电泳槽置于冰上或者4℃环境中,恒压100V进行电泳,直至缓冲液指示带距离凝胶底部2~3cm为止。(大约50-60min,根据实际情况调整电泳时间及电压;电泳时间不宜过长)

4、ZHUANMO

彩搜网(1)ZAIYULENGDE0.5XTBEZHONGJINPAONINGJIAO,MO,LVZHIHEXIANWEIDIAN。

彩搜网(2)ANRUXIASHUNXUZUZHUANG“SANMINGZHI”:XIANWEIDIAN,LVZHI,NINGJIAO,MO,LVZHI,XIANWEIDIAN。ZHUYIDIANJI,QUEBAONINGJIAOWEIYUYINJI、MOWEIYUYANGJI。

(3)在预冷的0.5XTBE中进行转膜。转膜装置应置于冰上或者低温室中,恒压60V转膜1h。(注意根据实际情况调整电压及时间)。

5、检测

彩搜网(1)QUCHUZHUANHAODEMO,FANGRUHESHIDESHENGYOUHUANCHONGYEDERONGQIZHONG,CHONGXI。(ZHUYIZHENGGEJIANCEGUOCHENGBIMIANMOGANZAO)

(2)QUDIAOCHONGXIHUANCHONGYE,JIARUFENGBIYEHOUQINGWEIZHENDANG,SHIWENFENGBI20min。

(3)JIARUSHILIANGDEHRPMEIBIAOJIDELIANMEIQINHESU(Streptavidin-HRP conjugate),SHIWENZHENDANGFUYU45min。(WUJIANGMEIBIAOJIWUZHIJIEJIADAOMOSHANG)

彩搜网(4)QUDIAOMEILIANWUXISHIYE,YONGXIDIHUANCHONGYEXIMOSANCI,MEICISHIWENQINGWEIZHENDANG1 0min。

(5)PEIZHIFANYINGDIWU,JUNYUNJIAZHIMOSHANG,SHIWENFUYU5min。(KEYIZAIJIAWANDIWUHOU,YONGBOMOQINGQINGFUGAIZAIMOSHANG,SHIDIWUJUNYUNFUGAI,ZHUYIBUYAOCHANSHENGQIPAO)

(6)化学发光成像系统曝光成像(曝光时间的长短可以根据检测方法不同而进行相应调整)。

三、实验结果展示(美国Signosis EMSA实验结果)

四、Super-Shift EMSA

FEICHUNHUADEDANBAIYANGBENHEYIGETEDINGDETANZHENKEXINGCHENGYIGEHUOJIGETEYIDEDANBAIFUHEWU。QUEDINGFUHEWUZHONGDANBAIDETEZHENGKENENGHUIKUNNAN,KEYIJIARUMUDEDANBAIDEKANGTI,JINXINGCHAOQIANYISHIYAN,JISuper-Shift EMSA。KANGTIHEDANBAI/TANZHENFUHEWUZHONGDEDANBAIJIEHE,SHIFUHEWUDEQIANYIYANCHI,XINGCHENGCHAOQIANYI。

Super-Shift EMSA工作原理;在反应体系中,抗体与DNA/蛋白复合物中的蛋白产生反应形成复合物会引起复合物的体积变大,在非变性凝胶中的移动变慢而与DNA/蛋白复合物区别开。

彩搜网进行Super-Shift EMSA需要考虑以下因素:

彩搜网1)YIBANXIANZUOYIBANDEEMSACEDING,CHENGGONGHOUCAIKAOLVZUOSuper-Shift EMSASHIYAN。

2)BUSHISUOYOUDEKANGTIDOUKEYIYONGYUSuper-Shift EMSA,ZHIYOUDUIFEIBIANXINGDANBAIDEBIAOMIANKANGYUANJUEDINGCUQIFANYINGDEKANGTICAINENGGOUYONGYUSuper-Shift EMSA。

3)KANGTIDENONGDUYAOGAO。YIBAN10-20ulDEFANYINGYEXUYAOSHIYONG0.5-1ulYUANBEIDEKANGTI。

彩搜网3)WEIJIANSHAOFEITEYIXINGFANYING,JINLIANGSHIYONGCHUNHUADEKANGTI。

4)单抗与多抗都可用于Super-Shift EMSA,但多抗可能与DNA/蛋白复合物形成大的聚集物而不进胶。在这种情况下,虽然看不到Super-Shift的带,但应当可以看到DAN/蛋白复合物的电泳带明显减少。

五、常见问题

1、WEISHENMEKANBUDAOQIANYIDAI?

1)DANBAIYANGBENTIQUZHILIANGBUGAO,DANBAIJIANGJIEHUOZHETIQULIANGBUZU。

2)YANGBENZHONGMEIYOUKEYIYUTANZHENJIEHEDEDANBAI。

彩搜网3)TANZHENYUDANBAIWUTEYIXINGDEXIANGHUZUOYONG。

彩搜网4)ZHUANMOXIAOLVDI,DANBAIHUOZHETANZHENWEIZHUANYIDAOMOSHANG。

5)PUGUANGHUOZHECHENGXIANGSHIJIANGUODUAN。

ZAISuper-Shift EMSACEDINGZHONGKANBUDAOSuper-Shift DNA/DANBAIFUHEWUDAIHAIKENENGYOUYIXIAYUANYIN:

6)KANGTIMEIYOUGONGZUO。BUSHISUOYOUDEKANGTIDOUKEYIYONGYUSuper-Shift EMSA,ZHIYOUDUIFEIBIANXINGDANBAIDEBIAOMIANKANGYUANJUEDINGCUQIFANYINGDEKANGTICAINENGGOUYONGYUSuper-Shift EMSA。

彩搜网7)CEDINGDEHUOHUADEDNA/DANBAIFUHEWUZHONGMEIYOUXIWANGJIANCEDEGOUCHENGCHENGFENCUNZAI。CISHIJIKANBUDAOSuper-ShiftDEDAI,YEKANBUDAODNA/DANBAIFUHEWUDELIANGDEJIANSHAO

彩搜网8)SHIYONGDEKANGTIGUODUXISHI。YIBAN10-20ulDEFANYINGYEXUYAOSHIYONG0.5-1ulYUANBEIDEKANGTI。

9)多抗与DNA/蛋白复合物形成大的聚集物而不进胶。在这种情况下,虽然看不到Super-Shift的带,但应当可以看到DAN/蛋白复合物的电泳带明显减少。

2、为什么实验背景高?

1)PUGUANGHUOZHECHENGXIANGSHIJIANGUOZHANG。

2)FENGBISHIJIANBUZUHUOZHEXIAOLVBUGAO。

3)XIDIXIAOGUOBUJIA。

4)SHIYANGUOCHENGZHONGMOMEIYOUYIZHICHUYUSHIRUNZHUANGTAI。


3、EMSA测定需要多少量的蛋白与标记的探针?

彩搜网DUIMEIYIGETEDINGDEJIEHEDANBAIHETANZHEN,SUOYONGDECHUNHUADANBAI,BUFENCHUNHUADANBAI,CUZHIHECHOUTIYEXUZUOYOUHUA:YIBANSUOYONGCHUNHUADANBAIDELIANGZAI20-2000ngJIAN,KEJIANGDANBAI:DNADEDENGMOERBIDIAOZHENGWEIDANBAIDEMOERSHUSHIDNADE5BEI;YONGCUZHIHECHOUTIYE,XUYAO2-10ugDANBAIXINGCHENGTEYIDEFUHEWU。

BUFENCHUNHUADANBAIYUCUZHIHECHOUTIYEYINGBAOCUNZAI-80℃、TANZHENYINGBAOCUNZAI-20℃YIFANGZHIJIANGJIE。

无论探针或是结合蛋白都应避免多次冻融。

4、Poly(dI:dC),非特异性竞争DNA,特异性竞争DNA在EMSA测定中的作用?

Poly(dI:dC)YOUJIGANHEBAOMIDINGZUCHENG。ZAIEMSAFANYINGZHONGJIARUpoly(dI:dC),KEYIZHICUZHIHECHOUTIYEZHONGZHUANLUDIAOJIEYINZIYUBIAOJITANZHENDEFEITEYIJIEHE。JIEHERONGYEZHONGDEpoly(dI:dC)DEYONGLIANGXUZAIZHENGSHISHIYANQIANJINXINGYOUHUA,YIBANYONGLIANGDAYUEZAI0.05mg/mlZUOYOU。DANGYONGCHUNHUADEDANBAIZUONINGJIAOQIANYIFANYINGSHI,BUBIYIDINGJIARUpoly(dI:dC),RUJIARU,ZEPUTONGFANYINGZHONGSUOYONGZHONGNONGDUBUCHAOGUO50-100ng。DUIHECHOUTIYE,MEI2-3ugHECHOUTIYEYONG1 ug poly(dI:dC)。

WEIQUEDINGSUOXINGCHENGDEFUHEWUDETEYIXING,ZAIHANHUOBUHANZENGLIANGDETEYIJINGZHENGDNAHUOFEITEYIDEJINGZHENGDNASHI,ZUOJIEHEFANYINGDEJINGZHENGSHIYAN。YIBAN,TEYIJINGZHENGTANZHENSHIFEIBIAOJIDEDNA,QIXULIEYUBIAOJITANZHENXIANGTONG,GUNENGYUBIAOJITANZHENJINGZHENGYUJIEHEDANBAIDEFANYING。FEITEYIJINGZHENGTANZHENDEZHANGDUZUCHENGHEDNATANZHENXIANGTONG,DANXULIEBUTONG。RUGUOJIEHEDANBAIYUBIAOJITANZHENDEJIEHEBEITEYIJINGZHENGTANZHENYIZHI,ERBUSHOUFEITEYITANZHENDEYINGXIANGBIAOMINGBAJIEHEDANBAIDECUNZAI。TEYIYUFEITEYIXINGJINGZHENGDNADEYONGLIANGYEXUYOUHUAHUODIDING,DANJINGZHENGDNATONGCHANGSHIBIAOJIDETANZHENYONGLIANGDE30-100BEI(w/w)。

彩搜网5、YONGSHENMENINGJIAOTIAOJIANJIANGDANBAIZHI/TANZHENFUHEWUHEYOULIDETANZHENFENLIKAI?

JIANGJIEHEDANBAIHUOCUZHIHECHOUTIYEHEMUDETANZHENJIEHE,DANBAI/TANZHENFUHEWUHEYOULITANZHENKEZAIFEIBIANXINGJUBINGXIXIANANNINGJIAOZHONGJINGDIANYONGFENLI。JUBINGXIXIANANDENONGDUYIBANWEI6%,ZAITEDINGTIAOJIANXIAKEYONGGAOHUODIDENONGDU。YEKEJIANGTGEHUANCHONGYE(12.5mM Tris,pH8.3,95mM GANANSUAN,0.5mM EDTA)YONGYUBUWENDINGDEDANBAI/DNAFUHEWU。ZAI4℃JINXINGJIEHEHEDIANYONGSHIYANYIZUZHIBUWENDINGFUHEWUHETANZHENDEJIELI。

彩搜网DANGDAIXINGBUJINMICHUXIANTUOWEISHI,BIAOMINGFUHEWUCUNZAIJIELI。NINGJIAOBIXUWANQUANJUHE,YIBIMIANDAIXINGTUOWEI。RUFUHEWUBUJINRUNINGJIAOZEBIAOMINGSUOYONGDEDANBAIHUOTANZHENGUOLIANG,HUOYANDENONGDUGUOLIANGBUSHIYONGYUZHEIYIFANYING。ZAIHANCHOUTIYEDEDAIZHONGBUHANYOULITANZHENHUOFUHEWU,DANZHIHANTANZHENDEDAIZHONGYOUTANZHENBIAOMINGCHOUTIWUYOUHESUANHUOLINSUANMEIWURAN,YINGZAICHOUTIYEZHONGHEJIEHEFANYINGZHONGJIARUXIANGYINGDEYIZHIJI。

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