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在NGS建库过程中,如何避免常见的操作失误
发布时间:2019-08-26   点击次数:96次

2013年,哈佛医学院的研究人员曾在《Nature Review Genetics》杂志上发表了一篇很有意思的综述,讨论了新一代测序(NGS)实验中错误的来源1。文章指出,在样品制备和文库制备环节,用户操作失误(user error)都是常有的事,比如贴错标签或者加错溶液。

然而,测序毕竟不同于核酸纯化,后者失败了大不了重做。对测序而言,一个简单的移液或混合错误有可能让你付出高昂的代价。无论老板是否nice,测序实验从头再来的感受肯定不佳,实验室需要耗费大量的时间和成本,况且有些样本还很稀有。不过,每次要处理那么多的样本,即使打起十二分精神,还是难保不出错。

为了避免操作失误的发生,赛默飞想到了一个绝妙的好办法。Invitrogen Collibri系列文库制备试剂盒中的每种试剂都带有一种示踪染料,便于人们清晰观察文库制备过程。若你看到溶液均匀变色(比如从蓝色变为绿色,图1),则可以确信相关试剂已添加且彻底混匀。若是漏加了某种试剂,或者没有混合均匀,则观察不到预期的颜色变化。


图1. Collibri PS DNA文库制备试剂盒的颜色变化

不用担心,试剂中的惰性染料既不会干扰酶促反应,也不会影响测序结果。最后纯化所得的文库是澄清透明的。这种实时的颜色变化提示,让操作失误的可能性大大降低,也让你对文库制备的过程充满信心。

看到这里,你一定想知道,Collibri系列文库制备试剂盒包含哪些产品,适合哪些应用?其实,针对全基因组测序和转录组测序,此系列都有相应的试剂盒提供,均适用于Illumina的高通量测序仪。下面就让小编来一一介绍。

全基因组测序

▪ Collibri PS DNA文库制备试剂盒适用于物理片段化的基因组,支持1-1,000 ng的样本起始量
▪ Collibri PCR-Free PS DNA文库制备试剂盒同样适用于物理片段化的基因组,采用PCR-free的实验方案,支持500-1,000 ng的样本起始量
▪ Collibri ES DNA文库制备试剂盒适用于酶法片段化的基因组,支持1-500 ng的样本起始量
▪ Collibri PCR-Free ES DNA文库制备试剂盒同样支持酶法片段化的基因组,采用PCR-free的实验方案,支持100-500 ng的样本起始量

根据片段化方式的不同,Collibri DNA文库制备试剂盒可分为两大类:物理片段化(PS)和酶法片段化(ES)。物理方法片段化主要是利用机械破碎的方法将基因组随机打断,如超声破碎、雾化等。酶学方法片段化主要利用酶的剪切功能将基因组片段化。酶法片段化方式操作简单,但物理片段化方式的片段随机性更好。此外,每种试剂盒都有PCR扩增产品和PCR-free产品可选。

与同类产品相比,Collibri系列文库制备试剂盒能够在更短时间内完成建库。以Collibri PCR-Free PS DNA文库制备试剂盒为例,文库制备可在1.5小时内完成,而整个实验流程的总时间缩短至6.5小时。其他产品一般需要7小时以上,甚至超过10小时。

若起始材料有限,可以选择PCR方案。不管是PCR-free文库还是经PCR扩增的文库,都可以始终保持均一的GC覆盖度,将GC bias降至最低。即使是“测序困难户”,如bad promoters或GC含量高达75%的区域,覆盖度也优于同类产品,包括FFPE样本。这种高覆盖度使得突变检测的灵敏度和准确度得到增强。

经过实验证实,Collibri DNA文库制备试剂盒能够高效地检测新生突变(De Novo mutations)。不管是PCR方案还是PCR-free方案,它们都能够高效检测SNP,对于10 ng及以上的起始DNA样本量,Collibri PS DNA文库制备试剂盒的SNP recall高于98.8%(图2)。此外,即使是低起始量样本,插入突变检测的indel recall也高于同类产品。

Collibri DNA文库制备试剂盒包含了WGS文库构建所需的所有组分,除了核心酶组分以外,还包括磁珠及经特殊设计的indexed adaptors,无需再单独购买。试剂盒随附提供独特双端index(UDI)。与传统的CDI相比,UDI的使用大大降低了标签串扰(index hopping)的比例。


图2. 高效检测突变

全转录组测序

Collibri RNA测序建库流程不同于市面上一般的RNA-Seq建库流程。RNA经酶片段化后直接与adaptor(含有辅助oligo)连接,之后逆转录形成cDNA,最后再通过PCR扩增引入index(图3)。

这种独特的建库流程可保留样本的复杂度,适用于不同质量的样本类型,如完整RNA、降解RNA、FFPE样本等。使用统一引物进行cDNA合成,不会受GC含量的影响,且无需引入随机Oligo序列,避免检测SNP或点突变时出现假阳性。


图3. Collibri RNA测序建库流程

Collibr™ Stranded RNA文库制备试剂盒同样能够实现快速建库。包括rRNA去除在内,转录组文库构建可在6。5小时内完成。这样使得从RNA提取到文库构建完成的总时间缩短至10。5小时左右。

可选的Collibri H/M/R rRNA Depletion Kit还能从100-1000 ng人、小鼠或大鼠总RNA中高效去除rRNA。与市面上其它rRNA去除方法不同,这种试剂盒基于亲和探针杂交和磁珠纯化方法,可特异高效地去除rRNA序列。探针的数量和靶向位置均经精心设计,可以去除28S、18S、5。8S、45S、5S、mt16S和mt12S核糖体序列。

Collibri RNA文库制备试剂盒内包含RNA-Seq文库构建所需的所有组分,除了片段化酶、RNA末端修饰试剂、Adaptor、连接酶、反转录试剂、文库扩增试剂外,还包含rRNA去除试剂、纯化磁珠以及index primer等。

文库定量

基于qPCR的Collibri文库定量试剂盒能够对文库有效浓度进行准确定量,适合大批量样本的文库定量。该试剂盒包含Collibri文库定量预混液、Collibri DNA标准品和Collibri文库稀释缓冲液。在文库定量时,使用一组6个预先稀释的DNA参考标准品来生成标准曲线,通过这一标准曲线可测定样本文库浓度。

基于Invitrogen™ Platinum™ II Taq 热启动DNA聚合酶的qPCR预混液含有靶向Illumina P5和P7 Adaptor序列的引物。Platinum II Taq 热启动DNA聚合酶可以均匀扩增GC含量不同和长短各异的DNA片段,因此是定量测序文库的理想选择。

与荧光检测方法相比,qPCR检测近测定含有P5和P7 Adaptor的文库片段,因此能够更加特异和准确地检测NGS测序文库。Collibri检测十分灵敏,可以定量飞摩尔量级的片段文库。起始量要求极低,通常仅需4 μL稀释的文库样本,浓度>0.0002 pM即可。同样,颜色指示可降低反应配制期间移液错误的风险。

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