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抗体敲除验证:捍卫实验标准 确保抗体特异性
发布时间:2018-12-13   点击次数:117次

据估计,因抗体质量不佳, 生命科学领域每年的损失达到 8 亿美元。这也造成了无数的实验失败,浪费了宝贵的资源和科学家的时间。尽管科学界已经意识到这个问题,但目前仍然缺乏抗体验证的整体框架。

为了刺激研究界实现更高标准的抗体重复性,国际抗体验证工作组(IWGAV)于 2016 年 9 月份出台了一套抗体验证指南并发表在《Nature Methods》杂志上, 题为「A Proposal for Validation of Antibodies」, 强调了抗体验证需要针对应用和背景来开展。文章提出了五点,以指导特定应用中的抗体验证。

 

 

• 遗传策略:测定对照细胞或组织中的相关信号,这些对照中的目标基因已利用 CRISPR 或 RNAi 等技术敲除或敲低。

• 正交策略:利用不依赖抗体的方法定量多个样品,然后检查依赖抗体和不依赖抗体这两种定量之间的相关性。

• 独立抗体策略:找到多个抗体来识别目标蛋白上面的不同表位,一般来说,蛋白质的 C 端具有较好的亲水性、表面可及性和柔性,所以是很好的抗原决定簇区域。在人蛋白质中,约 81% 的蛋白质其 C 末端的 5 个氨基酸残基的小肽是该蛋白质所特有的,制备针对蛋白质 C 末端小肽的抗体,常常能得到特异性识别该全蛋白的抗体。另外,蛋白的二级结构是 B 细胞表位计算机预测的重要参数之一,β转角为凸出结构,多出现在蛋白质抗原表面,有利于与抗体结合,较可能成为抗原表位。而α螺旋和β折叠结构规则不易变形,较难结合抗体,一般不作为抗原表位。含有 5 个以上的氨基酸残基的转角又常称为环 (loop)。以往的研究表明,蛋白表面的 loop 区可能为功能性抗体的识别位点,特异性好,可及性强。利用这类似抗原性分析结果,找到两个或者多个独立抗体,再通过比较和分析定量来确认特异性。

• 表达标记蛋白:修饰内源的目标基因,增加亲和标签或荧光蛋白的序列。标记蛋白的信号可与基于抗体的检测相关联。该方法有其局限性,当目标蛋白较小,或者结构较敏感的时候,融合亲和标签或者荧光蛋白有可能在结构上影响目标蛋白,从而改变其免疫原性。

• 免疫捕获加上质谱分析:将免疫捕获与 MS 分析相结合,以确定与纯化的抗体直接作用的蛋白质,以及可能与目标蛋白形成复合物的蛋白质。该方案能够确定与纯化的抗体直接作用的蛋白质,以及可能与目标蛋白形成复合物的蛋白质,但是需要依赖昂贵的仪器和实验材料,对于一般实验室而言,难以普及。

通过比较上述五种方案,遗传方案利用 CRISPR 或者 RNAi 技术敲除或者降低目的蛋白表达,是比较直接有效的方法,将敲除后细胞系作为负对照与野生型平行比较,如果抗体是真的特异的,在敲除细胞系中就不会检测到目的蛋白的信号,但在野生型中就会检测到特定的信号。因此,敲除验证的方法可以提供一个阴性对照用于验证抗体对目的蛋白的特异性。

该方法虽然直接,但是如果很难得到该基因敲除后细胞系,该实验方法的可行性将大幅度降低。不过随着生命科学领域市场的不断完善,商业化的 Knockout Cell(KO 细胞)裂解液已经比较成熟。市面上销售的多种细胞系 Knockout Cell(KO 细胞)裂解液已经有上千种。如果您研究的目的基因正好有商业化 Knockout Cell(KO 细胞)裂解液,将节省您和大量的资源和宝贵的时间。

以图为例 —— HER2 鼠单抗特异性的敲除验证:

WT: Hela 野生型细胞裂解液 (OriGene Cat# LC810 HELA),

KO: HER2-Knockout Hela 细胞裂解液 (OriGene Cat# LC810070),

Western blot 一抗:HER2 鼠单抗 (OriGene Cat# UM500036),

内参抗体:ß-actin 鼠单抗 (OriGene Cat# TA811000),

使用浓度:1:500。

结论:该 HER2 鼠单抗 (OriGene Cat# UM500036) 经敲除验证,具有极强的特异性。

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